Listeria monocytogenes est une bactérie ne présentant pas d'exigence particulière et qui peut croître sur des milieux de culture non enrichis. En pratique courante, l'isolement est réalisé sur gélose au sang afin d'obtenir une croissance optimale et d'observer une zone hémolyse de type bêta (hémolyse complète des hématies), souvent étroite. Les colonies sont circulaires, lisses, translucides, de 1 à 1.5 mm de diamètre après 24h d'incubation à 37°C.

Sur des milieux transparents comme la gélose nutritive , les colonies jeunes sont translucides et prennent un reflet bleu-vert en lumière oblique.

La gélose au sang + acide nalidixique (Négram) permet d'isoler plus facilement la bactérie à partir de prélèvements plurimicrobiens, l'acide nalidixique inhibant un certain nombre de bacilles à Gram négatif.