S. pneumoniae fait partie des cocci à Gram positif, de forme légèrement ovoïde (aspect typique en fer de lance ou flamme de bougie), classiquement groupés en diplocoques, ce qui les différencie notamment des staphylocoques, généralement parfaitement sphériques et groupés en amas ; ces diplocoques sont souvent entourés d'une zone claire/réfringente qui révèle la présence habituelle d'une capsule (cf. illustration ci-dessous).

S. pneumoniae ne se développe pas sur milieu hypersalé au mannitol (milieu de Chapman), utilisé comme milieu sélectif, pour l'isolement des staphylocoques à partir de prélèvements pluri-microbiens et l'orientation vers l'espèce S. aureus qui fermente le mannitol.

Le test de l'oxydase est essentiellement utilisé pour le diagnostic différentiel au sein des bactéries à Gram négatif et n'a pas d'intérêt dans le diagnostic de pneumocoque. L'absence de catalase permet de différencier les streptocoques des staphylocoques.

S. pneumoniae fournit des colonies α-hémolytiques sur gélose au sang (lyse partielle des hématies → coloration verdâtre entourant les colonies vs lyse complète des hématies pour les streptocoques β-hémolytiques) ; contrairement aux autres streptocoques, le pneumocoque ne se développe pas autour d'un disque d'optochine (cf. illustration A. Reynaud) ; par ailleurs, les colonies sont lysées par dépôt d'une solution de sels biliaires.

S. pneumoniae est une bactérie non flagellée, immobile.