FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfert)

• Le FRET pour Förster ou Fluorescence Resonance Energy Transfer (Förster, 1948).

  • Si l'accepteur est fluorescent, il y a transfert d'énergie de fluorescence par résonance qui correspond à un transfert d'énergie entre un donneur fluorescent dans son état excité, à un composé excitable, l'accepteur, par une interaction dipole-dipole non radiative.

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• Conditions du FRET :

  • un donneur fluorescent de durée de vie suffisamment longue

  • le transfert ne doit pas inclure de résorption effective de la lumière par l'accepteur

  • le spectre d'émission de la molécule « donneur » doit recouvrir le spectre d'excitation de la molécule « accepteur »

  • la distance entre le donneur et l'accepteur est faible ( 1 à 10 nm)

• La technique du FRET utilise 2 fluorophores : un donneur qui va transmettre son énergie à un autre fluorophore accepteur. Elle permet d'étudier des interactions entre 2 molécules

  On distingue 2 cas pour les expériences de FRET.

1. Les fluorophores sont portés par deux molécules différentes  : de leur association ou de leur dissociation résultera une variation du signal de FRET.

2. Les fluorophores sont portés par la même molécule  : un changement de conformation de celle-ci se traduira par une modification de la distance entre les deux fluorophores et une variation de l'intensité du signal de FRET.

Le FRET résulte

• en une diminution de la fluorescence et de la durée de vie du donneur

• et en une augmentation de la fluorescence de l'accepteur

• La qualité du transfert dépendra de différents paramètres parmi lesquels 2 jouent des rôles prépondérants :

  • le recouvrement entre les spectres d'émission du donneur et d'excitation de l'accepteur

  • la distance entre les fluorophores considérés

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Le spectre d'émission du donneur doit recouvrir partiellement le spectre d'absorption de l'accepteur Sa quantification JAD  (intégrale de recouvrement spectral) intervient dans la quantification du FRET.

Le facteur de recouvrement spectral permet d'évaluer la distance Ro (rayon de Förster) pour laquelle l'efficacité de transfert est de 50%. Ce paramètre varie donc en fonction des fluorophores considérés.

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• La mesure expérimentale du FRET correspond à la détermination de l'efficacité de transfert.

• Cette efficacité de transfert se modélise à partir du traitement théorique de Förster qui permet de déterminer la distance entre le donneur et l'accepteur.

• L'efficacité de transfert se définit comme le rendement quantique du phénomène de transfert d'énergie. Par analogie avec le rendement quantique de fluorescence (nombre de photons émis sur nombre de photons absorbés), le rendement quantique de transfert correspond au nombre de molécules qui se désexcite par transfert sur le nombre total de molécules excitées.

  Constante cinétique de transfert	R0 distance de Förster : distance entre chromophore pour laquelle il y a 50% d'efficacité de FRET R distance entre les fluorophores
  Efficacité de transfert ou rendement du transfert	E = nb de molécules qui se désactivent par transfert / nb total de molécules excitées

Calcul de R0 (distance entre les chromophores pour laquelle il y a 50% d'efficacité de FRET) :

JAD: recouvrement des spectres d'émission du donneur et d'absorption de l'accepteur : rendement quantique du donneur n : indice de réfraction du milieu N : nombre d'Avogadro : facteur d'orientation (fonction de l'orientation entre les dipôles électroniques d'émission du donneur et de l'accepteur)

• L'association entre les deux partenaires portant chacun un fluorophore résulte en un signal de FRET. Cette configuration est certainement la plus courante. cette stratégie a ainsi permis de montrer la dimérisation de récepteurs couplés aux protéines G, d'analyser la fixation d'un ligand sur un récepteur, d'étudier la composition en sous-unités des canaux GABAA, de mettre en évidence l'interaction de canaux ioniques de type L avec la calmoduline .

• Il est également possible de mesurer la baisse de signal de FRET liée à la dissociation des deux partenaires lors d'une compétition par une troisième molécule.

• A la suite d'un changement de conformation de la protéine portant les fluorophores, une augmentation du signal de FRET sera enregistré dans la mesure où les fluorophores se rapprocheront et inversement une diminution de FRET lorsque les fluorophores s'éloigneront.

• Plus la distance entre donneur et accepteur est petite plus la probabilité de voir du FRET est importante

• L'efficacité de FRET peut être améliorée en choisissant un couple donneur-accepteur avec un fort recouvrement des spectres d'absorption et d'émission

• Mesure de distances moléculaires, étude d'interaction de type ligand-récepteur, étude de conformations de macromolécules

• Etude de la liaison d'un ligand

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• Mesure d'interaction récepteur –ligand

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