Polarisation de fluorescence - Anisotropie

• Tout changement de direction des moments de transition pendant la durée de vie de l'état excité provoquera une diminution de l'anisotropie, c'est à dire induira une dépolarisation partielle ou totale de la fluorescence.

• L'anisotropie est une mesure de la dépolarisation de fluorescence.

• La dépolarisation de fluorescence peut être causée par plusieurs phénomènes dont l'importance relative dépend de l'échantillon étudié (mouvement brownien, vibration de torsion, transfert d'énergie ...), mais la principale cause est la rotation par diffusion des fluorophores .

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Seules les molécules dont le moment dipolaire de transition est proche de la direction de polarisation de la lumière sont excitées. La direction de l'émission de fluorescence dépend de la liberté de rotation du fluorophore dans le milieu.

Le degré de polarisation de fluorescence est défini par le taux de polarisation (p) ou par l'anisotropie (r) représente l'intensité de fluorescence émise parallèlement au rayon incident représente l'intensité de fluorescence émise perpendiculairement au rayon incident représente l'intensité totale

taux_anisotropie

• Relation entre l'anisotropie et le taux de polarisation et

Loi d'additivité de l'anisotropie :

• Quand l'échantillon contient un mélange de fluorophores, chacun d'eux a sa propre anisotropie d'émission ri et chacun contribue à la fluorescence totale avec une fraction fi ( contribution relative à l'intensité totale ; .

• L'anisotropie d'émission totale est la somme pondérée des anisotropies individuelles

L'anisotropie d'un mélange ne décroît pas forcément de façon monotone. Tout dépend des ri et pour chaque constituant du mélange. On a une anisotropie « apparente ». faible valeur de r (0,116) : pas de liaison valeur élevée de r (0,153) : liaison totale intermédiairement, on a un certain pourcentage de liaison Les mesures d'anisotropie permettent d'étudier les interactions entre une macromolécule et un ligand.

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• Les molécules de petite taille tournent rapidement et émettent de la lumière dépolarisée alors que les molécules plus grosses tournent lentement et, par conséquent, émettent de la lumière moins dépolarisée.

• La dépolarisation dépend :

  • de l'angle entre les moments de transition d'absorption et d'émission

  • des mouvements de rotation brownienne

• Ce mode de dépolarisation est décrit dans le cas le plus simple d'une molécule sphérique par l'équation de Perrin.

  r0 : anisotropie fondamentale : durée de vie de fluorescence : temps de corrélation de rotation DR : coefficient de diffusion de rotation : viscosité du milieu T : température absolue V : volume du fluorophore k : constante de Boltzmann

• Un ligand marqué par une molécule fluorescente tourne rapidement, la lumière est fortement dépolarisée. Le taux de polarisation et par conséquent, l'anisotropie seront faibles

• Si le ligand marqué par la molécule fluorescente est fixé sur une grosse molécule comme par exemple un récepteur, il tournera moins rapidement et la lumière sera faiblement polarisée. Le taux de polarisation et l'anisotropie seront élevés.

La technique de polarisation de fluorescence est un outil très puissant pour :

• Quantifier

  • la dénaturation de protéines

  • les équilibres d'association quand les espèces libres et liées impliquées dans 'équilibre ont des vitesse de rotation différentes

  • la dynamique interne de protéines

• Estimer

  • la fluidité interne des membranes

  • la température de transition de phase

  • l'ordre des milieux organisés.