2. Purification par chromatographie flash des alcaloïdes de l'extrait
GENERALITES :
La chromatographie flash (chromatographie liquide moyenne pression), permet en une analyse la séparation des composés d'un mélange à pression moyenne, avec une résolution convenable. Les composés se séparent en fonction de leurs affinités respectives pour la phase stationnaire et la phase mobile. La phase stationnaire peut être une phase normale (polaire de type silice) ou une phase inverse (apolaire de type silice greffée en C18), et est contenue dans une cartouche plastique qui est généralement à usage unique. La phase mobile ou éluant est classiquement constituée par un mélange de solvants dont la composition peut varier au cours du temps, notamment lors de l'utilisation d'un gradient.
Ce type de séparation nécessite une mise au point et une optimisation. Ainsi, l'éluant est déterminé après différents essais à la fois sur CCM et sur l'appareil, afin d'obtenir les conditions idéales de séparations. Plusieurs paramètres sont ainsi définis comme : le débit, le temps d'analyse, le gradient ...
L'appareil utilisé au cours de cette séance permet une séparation et une collecte automatique des fractions. Il dispose d'un détecteur UV intégré en sortie de colonne et permet ainsi de suivre l'élution des composés absorbant les UV.
Voici une description succincte de l'appareil utilisé au cours de ces séances de travaux pratiques :
PARTIE EXPERIMENTALE :
Préparation de l'échantillon :
Les deux solutions (extraits de Quinquina) sont réunies et 15 mL sont évaporés à sec à l'évaporateur rotatif. Le résidu sec est repris dans 2 mL de dichlorométhane, et la solution est filtrée dans un tube à hémolyse.
Préparation de l'appareil :
Ajouter des tubes à essais dans la première rangée
Charger la méthode « Quinine-TP »
Modifier le nom de l'échantillon : Initiales + date
Vérifier les paramètres d'élution et de collecte
Purger les tubulures avec les solvants B puis A (le plus apolaire)
Installer la colonne
Lancer le programme (qui commence par une équilibration de la colonne)
Charger la boucle d'injection (1 mL du filtrat)
Lancer l'analyse
Paramètres utilisés :
Phase stationnaire : Colonne de Silice GRACE® 4g
Phase mobile : Solvant A = Dichloométhane + 1% diéthylamine
Solvant B = Méthanol + 1% diéthylamine
Débit : 18 mL/min
Temps d'analyse : 10 minutes
Gradient :
- 0 min : 98% A / 2% B
- 8 min : 96% A / 4% B
- 10 min : 93% A / 7% B
Collecte : 18 mL/tube
Détection : de 200 à 400 nm
Attention :
Toujours vérifier la pression (une surpression risque de provoquer des fuites et détériorer la pompe)
La solution injectée ne doit pas présenter de particules en suspension (risque de colmatage et de surpression)
Extinction de l'appareil :
Purger les tubulures à l'isopropanol.
