C'est un petit bacille à Gram positif, droit, de 0,4 à 0,5 µm de diamètre sur 0,5 à 2 µm de long, aux extrémités arrondies, se disposant le plus souvent en palissade, en diplobacille, rarement en courtes chaînes. Sa mobilité est surtout observable vers 25°C. Cette bactérie n'est pas sporulée, ni capsulée.
Cette bactérie est aérobie-anaérobie facultative et n'est pas exigeante. Les milieux de culture sont habituellement incubés en aérobie, la croissance sous CO2 (5 à 10%) est possible. Sa croissance est stimulée par l'addition de glucose ou de sang. Sa température optimale de croissance se situe entre 30 et 37°C, mais la croissance paraît démontrée de -2 à +45°C. Les bactéries survivent à la congélation.
Le pH optimal de sa croissance est de 7 ou légèrement alcalin. Listeria monocytogenes présente une halotolérance et peut croître en présence de 10% de NaCl. Certaines souches tolèrent des concentrations en sel supérieures à 10%. En clinique humaine, les prélèvements sont souvent isolés sur gélose au sang à 5% (sang de cheval ou mouton).
Les colonies sont circulaires, d'environ 1 à 1,5 mm de diamètre après 24H. d'incubation sur gélose au sang et une étroite zone d'hémolyse totale (bêta-hémolyse) est visible en périphérie des colonies (zone d'hémolyse qui n'est parfois observable que sous les colonies). L'isolement de Listeria monocytogenes est parfois réalisé sur milieux sélectifs comme la gélose au sang + acide nalidixique (inhibant des bacilles à Gram négatif) quand la recherche est effectuée à partir d'un prélèvement plurimicrobien. D'autres milieux de culture sélectifs sont utilisés dans l'agro-alimentaire (exemple : gélose type PALCAM ou Oxford).
Le genre Listeria est un petit bacille à Gram positif possédant une catalase et ne possédant pas d'oxydase. L'identification peut être effectuée par exemple sur galerie Api Listeria bio Mérieux. Sur cette galerie, cette bactérie donne les résultats suivants : hydrolyse de l'esculine, présence d'une alpha-mannosidase, acidification du D-arabitol, du L-rhamnose, du méthyl- alpha D- glucopyranoside, mais pas d'acidification du D-xylose, du D-ribose, du glucose-1-phosphate, du D-tagatose. Le caractère DIM est négatif pour Listeria monocytogenes. Listeria monocytogenes ne produit pas d'indole, ni d'H2S et ne possède pas de nitrate réductase, ni d'uréase , ni de gélatinase.
La recherche de gènes après amplification génique est rarement utilisée en clinique humaine, alors que ces méthodes se sont développées dans le cadre des contrôles des aliments. Dans le cadre du diagnostic des listérioses humaines, la recherche de Listeria monocytogenes par amplification génique (PCR par exemple) directement dans le prélèvement (sang, LCR) peut être effectuée dans quelques laboratoires spécialisés, quand le traitement antibiotique a été instauré avant la réalisation des prélèvements et/ou en cas d'encéphalite si les techniques classiques sont mises en défaut.