TP Numérique : A la recherche du calcium intracellulaire

Trois grandes méthodes sont possibles :

• Avec du calcium 45 radioactif. On incube les cellules avec un milieu riche en Ca⁴⁵ en présence ou absence d'agonistes / antagonistes. Après lavage, on mesure la radioactivité des cellules pour en déduire les flux calciques.

• Avec une électrode de mesure du calcium implantée dans la cellule. Cette électrode miniaturisée est similaire à une électrode de pH mais mesure des ions calcium au lieu des ions H⁺.

• Avec une sonde fluorescente, technique que nous allons décrire dans les chapitres suivants.

Ces sondes ont la propriétés de se lier au calcium. Cette liaison va augmenter ou diminuer la fluorescence de la sonde.

Le choix de la sonde est fonction de :

A- La sonde peut être chimique ou protéique. Les sondes chimiques sont généralement des dérivés fluorescents de chélateurs du calcium comme le BAPTA. Une sonde protéique peut-être transfectée. Elle dérive généralement d'un domaine de liaison au calcium comme celui de la calmoduline.

B- La « couleur » de la sonde. En fonction de son matériel et des interférences avec d'autres sondes lumineuses, il est nécessaire de bien connaître la longueur d'onde d'excitation et d'émission de la sonde. Il existe ainsi des sondes qui émettent dans le vert ou dans le rouge.

C- L'affinité de la sonde pour le calcium (Kd). Le Kd de la sonde doit être proche des valeurs de calcium que l'on veut mesurer pour que l'on puisse suivre des variations de fluorescence. Si le Kd n'est pas adapté, la sonde risque d'être saturée par le calcium ou de ne pas se lier au calcium. Il existe ainsi des sondes pour mesurer le calcium dans l'ordre de 300 nM (concentration par exemple dans le cytoplasme) ou dans l'ordre du mM (concentration par exemple dans les organites riches en calcium).

En fonction de la fluorescence et grâce à ces courbes de calibration, on peut estimer la concentration calcique.

D- Sonde ratiométrique à deux longueurs d'ondes.

Dans l'équation précédente Fmin et Fmax sont très variables en fonction des cellules et de la quantité de sonde qui est rentrée dans la cellule. De plus en cours de manipulation ces valeurs peuvent varier suite à une extinction de la sonde ou à une modification du volume de la cellule. L'utilisation des sondes à deux longueurs d'onde présente l'avantage majeur de pouvoir évaluer les concentrations absolues de Ca²⁺ sans qu'il soit nécessaire de quantifier systématiquement, à la fin de chaque expérience, la concentration de la sonde dans la cellule. En outre, ce mode de calcul s'affranchit des problèmes de fuite ou d'extinction de la sonde au cours de l'expérience. En faisant le ratio entre les deux longueurs d'onde mesurer, on est donc plus précis dans la mesure.

Pour un exemple de sonde ratiométrique, voir l'exemple de l'indo-1

E- La capacité de la sonde à traverser les membranes. Il est nécessaire que la sonde puisse rentrer dans la cellule, sinon il faut l'injecter. Certaines sondes sont modifiées (rajout de groupements acetoxyméthylester) pour pouvoir rentrer dans la cellule.

F- La distribution de la sonde. Certaines sondes se distribuent dans le cytoplasme, d'autres ont plus d'affinité pour un compartiment comme la mitochondrie ou le réticulum

La sonde Fluo4 (formule chimique en A) est très largement utilisée pour mesurer la [Ca²⁺]_i dans de très nombreuses cellules. C'est une sonde mono excitation et mono émission. Son spectre d'excitation et d'émission est représenté en B. Elle permet de mesurer la [Ca²⁺]_i entre 20 nM et 1 µM (figure C). On incube les cellules avec 1µM de Fluo4-AM (forme acetoxymethyl ester) pendant 30 minutes à 37°C. Apres un lavage, on laisse reposer les cellules pendant 15 minutes pour que les estérases puissent agir. Les cellules sont prêtes pour la mesure de la [Ca²⁺]_i.

La sonde ratiométrique indo-1 (formule chimique en A) est très largement utilisée pour mesurer la [Ca²⁺]_i. C'est une sonde mono excitation et double émission. Ses spectres d'émission sont représentés en B. Quand la [Ca²⁺]_i augmente, la fluorescence augmente à 405 nm et diminue à 480 nm. On mesure le ratio (Δ) entre les valeurs à 405 et 480 nm. Ce ratio permet d'estimer plus finement la [Ca²⁺]_i car il ne dépend pas de la concentration initiale de la sonde dans la cellule, ni de ses variations au cours du temps (comme le photo-blanchiment).

Elle permet de mesurer la [Ca²⁺]_i entre 40 nM et 1 µM (figure B). On incube les cellules avec 1µM d'indo-1-AM (forme acetoxymethyl ester) pendant 30 minutes à température ambiante. Après un lavage, on laisse reposer les cellules pendant 15 minutes pour que les estérases puissent agir. Les cellules sont prêtes pour la mesure de la [Ca²⁺]_i.

Source : d'après https://www.thermofisher.com