Exercice 1
On désire étudier une α-glucosidase, enzyme hydrolysant spécifiquement les glucosides liés en 1α. L'enzyme est dissoute en tampon, le substrat utilisé est le méthyl-1α-glucose (méthylglucose) à 50 µmoles.L-1, et les produits formés sont le méthanol et le glucose.
Dans une première expérience, on mesure la concentration d'un des produits (P) formés en fonction du temps :
[P] en nmole.L-1 | t en secondes (s) |
|---|---|
10 | 60 |
20 | 120 |
30 | 180 |
40 | 240 |
45 | 300 |
48 | 360 |
Question
1- Ecrivez le schéma de la réaction catalysée par l'enzyme. Comment est assurée la spécificité de substrat ? Cette réaction est-elle dans le sens thermodynamiquement favorable ?
La spécificité de substrat est assurée par le groupement glucosyle, puisqu'il s'agit d'une glucosidase, enzyme catalysant l'hydrolyse de substrats dérivés du glucose lié à un groupement chimique, ici méthyle, par une liaison O-osidique (ou glycosidique). Cette liaison met en jeu le carbone anomérique du glucose sous forme cyclisée (liaison hémiacétalique, voir le cours de Biochimie structurale). Le respect de l'anomérie est important pour la reconnaissance par l'enzyme ; le substrat étant le méthyl-1α-glucose, il assure la spécificité anomérique de l'α-glucosidase, qui n'hydrolyse que les substrats glucosylés en 1α.
Il s'agit d'une réaction d'hydrolyse, donc exergonique en faisant perdre une liaison riche en énergie (la liaison glycosidique) au substrat. La somme des énergies de liaison contenues dans les produits, glucose et méthanol, est inférieure à celle du composé de départ, le méthylglucose. Nous travaillons donc dans le sens thermodynamiquement favorable. La réaction de retour est improbable spontanément, une réaction de synthèse de ce type demandant un apport énergétique relativement important (réaction endergonique).
Question
2- Quelle est la durée de la phase stationnaire ?
La concentration du produit mesuré augmente linéairement de 10 nmoles.L-1 toutes les 60 sec jusqu'à 240 secondes (s), où l'augmentation devient moins forte (5 puis 3 nmoles.L-1 par 60 s). La phase stationnaire pendant laquelle on pourra mesurer une v0 dure donc jusqu'à 240 s. Ensuite la vitesse devient dépendante de la concentration de substrat, qui diminue ; nous ne sommes plus en cinétique d'ordre 0 mais d'ordre 1.
Question
3- Quelle est l'activité de cette α-glucosidase, en katal.L-1 et en UI.L-1 ?
Déterminer une activité enzymatique revient à mesurer une vitesse initiale (v0), donc dans les conditions énoncées par Michaelis et Menten. Une telle v0 peut être mesurée pendant la phase stationnaire que l'on vient de définir :
v0 = - dS/dt = dP/dt
ici v0 = ΔP/Δt = 10 nmoles.L-1 / 60 s ≈ 0,167 nmoles.s-1.L-1
Le katal est défini comme étant la quantité d'enzyme permettant de catalyser la transformation d'une mole de substrat par seconde (unités SI). Donc l'activité de l'α-glucosidase est de 0,167 nkat.L-1 dans le milieu réactionnel.
L'unité internationale (UI) est définie comme étant la quantité d'enzyme permettant de catalyser la transformation d'une µmole de substrat par minute, soit ici 10.10-3 µmole.min-1.L-1 ou 0,01 UI.L-1.
Et si on avait pris l'ensemble de la cinétique pour le calcul, on aurait obtenu un résultat faussement trop bas : 48/360 ≈ 0,133 nkat.L-1.
Le katal fait référence aux catalyseurs quelle que soit leur nature, chimique ou enzymatique ; cette unité est exigée par les revues internationales. Mais, en biologie médicale, on utilise encore l'UI (souvent appelée simplement U) car beaucoup de valeurs usuelles (sériques en particulier) ont été obtenues dans cette unité et sont largement répandues dans la communauté scientifique médicale.
Question
4- Aurions-nous obtenu les mêmes résultats selon que l'on dose le méthylglucose, le méthanol ou le glucose ? Lequel semble le plus aisé à doser ?
Oui, on aurait obtenu les mêmes résultats, puisque la réaction est équimoléculaire : 1 mole de méthylglucose réagit avec 1 mole d'eau pour donner 1 mole de méthanol et 1 mole de glucose.
Le méthylglucose n'est certainement pas facile à doser, par contre le glucose est aisément quantifiable par des méthodes chimiques de groupe ou, plus spécifiquement, par des méthodes enzymatiques ! Quant au méthanol, il est dosable par diverses méthodes (voir Cours de Chimie Analytique). Et doser de l'eau, ce n'est pas si simple !
Dans une deuxième expérience, on détermine par la même méthode les v0 en fonction de la concentration de substrat (S), et on obtient les résultats suivants :
[S] En µmoles.L-1 | V0 en nkat.L-1 |
|---|---|
1 | 16.7 |
2 | 28.6 |
5 | 50 |
10 | 66.7 |
40 | 88.9 |
50 | 90.9 |
100 | 95.2 |
200 | 97.6 |
Question
1- Cette α-glucosidase est-elle une enzyme michaelienne ? Si oui, quelle est sa Km pour le méthylglucose ?
Les v0 augmentent avec la concentration de substrat, et semblent tendre vers une limite que l'on peut estimer à 100 nkat.L-1. Si on pose l'hypothèse que l'α-glucosidase est une enzyme michaelienne, tous les points doivent répondre à l'équation de Michaelis-Menten, soit :
v0 = Vm.S/(Km + S) donc Km = S/v0.(Vm - v0)
et donc que, ayant fixé Vm, tous les couples v0/S doivent donner la même Km ; essayons :
- pour S = 2, v0 = 28,6 : Km = 2/28,6.(100 - 28,6) = 4,993 donc Km ≈ 5 µmoles.L-1
- pour S = 50, v0 = 90,9 : Km = 50/90,9.(100 - 90,9) = 5,006 ≈ 5 µmoles.L-1
Et finalement on trouverait le même résultat pour tous les couples v0/S, donc l'α-glucosidase est michaelienne pour le méthylglucose, et bien sûr sa Km = 5 µmoles.L-1. On peut remarquer que cette valeur de Km est dans le tableau de résultats ; c'est la concentration de substrat permettant d'atteindre Vm/2 (si Vm = 100, Vm/2 = 50, valeur qui correspond à [S] = 5 µmoles.L-1).
Question
2- Dans l'essai enzymatique, quelle proportion de Vm la concentration de substrat utilisée permet-elle d'assurer ? Cette concentration vous semble-t-elle adéquate pour déterminer l'activité de l'α-glucosidase dans des milieux biologiques variés ?
La concentration de substrat utilisée est de 50 µmoles.L-1, donc :
v0 = Vm.S/(Km + S) = 100.50/(5 + 50) = 90,9 en nkat.L-1
(valeur que l'on trouve aussi dans le tableau)
donc elle permet d'atteindre 90,9 % de Vm (≈ 90 %)
Cette concentration égale à 10 Km permet la détermination de l'activité de l'α-glucosidase dans des milieux de concentration en enzyme peu différente de celle que l'on vient d'analyser. Mais, on peut penser que cela ne serait pas le cas pour des milieux beaucoup plus concentrés en enzyme ; il faudrait alors préférer un essai avec 50-100 Km en concentration de substrat pour améliorer la linéarité de l'essai enzymatique.
Question
3- Rappelez les conditions à respecter pour déterminer une activité enzymatique.
- la concentration de substrat(s) doit être très grande devant la concentration d'enzyme afin de pouvoir effectuer des mesures de vitesse initiale sur une large gamme de concentrations d'enzyme ; des [S] entre 10 et 100 Km permettent habituellement de telles mesures en s'approchant de Vm.
- on doit choisir les conditions opératoires qui s'approchent de la plus grande Vm, donc au pH optimum, à la température optimale, en présence de la concentration optimale d'éventuels activateurs de l'enzyme, et en évitant au maximum les inhibiteurs.
- le milieu réactionnel doit aussi assurer la solubilité de l'enzyme et des réactifs, on choisit généralement un tampon assurant la stabilité du pH au cours de la réaction.
