Question 10
Question
Définissez les termes de vitesse maximale (Vmax ou Vm) et de constante de Michaelis (Km) en rappelant leurs unités et leurs significations. Quels sont les inconvénients de cette représentation graphique pour déterminer Vm et Km ?
La vitesse maximale (Vmax ou Vm) est la plus grande v0 que l'on peut atteindre en augmentant la concentration de S (dans des conditions définies). Son unité est la mole.s-1 (ou mole.s-1.L-1) comme pour toute v0.
La constante de Michaelis (Km) est la concentration de S permettant d'atteindre la moitié de la Vmax. Son unité est la mole.L-1 comme pour les concentrations de substrat.
Les inconvénients de cette représentation graphique sont ceux de la représentation hyperbolique : la valeur de l'asymptote est extrapolée ; elle sera souvent mal estimée. Il s'ensuit une erreur sur Km par Vmax/2 elle-même mal estimée. A cela s'ajoute la forme de l'hyperbole qui ne permet pas toujours une lecture précise dans un repère orthonormé.
Remarque :
La Vm peut être mesurée graphiquement sur le graphe de Michaelis-Menten comme étant la limite de la fonction v0 = f([S], son asymptote. Par la mesure de Vm on a aussi une mesure de k2 puisque si v0 = k2.ES, alors Vm = k2.ET, ET étant l'enzyme totale. On peut en déduire :
k2 = Vm/ET
Il suffit de déterminer graphiquement Vm et de calculer (ou mesurer) la concentration d'enzyme dans la solution. Vm représente donc la capacité catalytique de l'enzyme. On appelle aussi k2 la constante catalytique (kcat) ou constante de turn over. Cette dernière se définit comme étant le nombre de molécules de substrat transformées par seconde par une seule molécule d'enzyme dans les conditions de mesure de Vm ; il s'agit bien d'une constante de premier ordre, exprimée donc en s-1.
Si v0 = Vm/2 = Vm.S/(Km + S) alors 2 S = Km + S et S = Km ; donc Km (ou constante de Michaelis) est la concentration de substrat permettant d'atteindre Vm/2. C'est aussi le rapport algébrique des constantes cinétiques :
Km = (k-1 + k2)/k1
L'unité de Km est la mole/L (M) comme celle du substrat. On la retrouve aussi dans le rapport des constantes de vitesse :
(s-1 + s-1)/s-1.M-1 = M
L'expression de Km se rapproche de celle de la constante de dissociation du complexe ES (KD = k-1/k1); mais Km est lié à Vm par la constante k2. On considère aussi Km comme étant l'inverse de l'affinité du substrat pour l'enzyme (affinité = 1/Km) ; donc plus Km est faible plus l'affinité est élevée, et inversement (Km = 10-2 à 10-6 mole.L-1).
La détermination de Km d'après le graphe de Michaelis-Menten n'est pas toujours facile ni très précise : il faut disposer d'une large gamme de concentrations de substrat pour atteindre une Vmax mesurable, puis réaliser la projection de Vmax/2 (en ordonnées) sur l'axe des abscisses, ce qui n'est pas toujours aisé selon la façon dont l'hyperbole a été tracée. Très souvent Vmax est sous-évaluée, donc Vmax/2 aussi, et en projection Km sera trop bas (fausse bonne affinité !). Les méthodes de linéarisation permettent d'améliorer ces déterminations.
On définit l'efficacité catalytique comme étant le rapport kcat/Km (s-1.mole-1.L) ; donc plus kcat est élevée et Km faible plus l'efficacité de l'enzyme est grande.
