Cinétiques Enzymatiques

Avant d'atteindre la phase stationnaire (dES/dt = 0), la cinétique représente la formation du complexe ES. Mathématiquement l'augmentation de P et la diminution de S sont deux fonctions exponentielles (donc d'accélération de la transformation de S en P, cinétiques d'ordre 1) s'étendant vers une valeur fixe, la vitesse initiale (v₀), et la cinétique d'ordre 0. Par contre, la cinétique de la formation du complexe ES est une fonction hyperbolique ayant comme limite v₀ lorsque l'état stationnaire est atteint. A partir de ces courbes on peut mesurer les constantes cinétiques k₁ et k_-1. L'ordre de grandeur de la phase stationnaire est la milliseconde, voire la microseconde ; elle n'est donc pas étudiable par les méthodes classiques d'enzymologie, et, comme nous l'avons déjà dit, on ne la visualise pas sur le graphe cinétique P ou S = f(t) où la grandeur de temps est la seconde, voire la minute...

La principale méthode d'étude de la phase pré-stationnaire est le stopped-flow, un appareil permettant de mettre en contact très rapidement la solution de S et celle de E (mesure de cinétiques rapides, de l'ordre de la milliseconde). Comme les concentrations sont très faibles, on utilise surtout des substrats chromogènes ou fluorogènes, donnant généralement un produit absorbant dans le visible, ou dans l'UV, ou réémettant en fluorescence, dont on pourra ainsi mesurer la concentration dès son apparition. Le plus souvent, on mesure des temps de relaxation. Il est important pour ces études de disposer de substrats pour lesquels la Km est très faible, donc des substrats de très forte affinité, comme nous le verrons plus loin. On peut aussi utiliser l'approche de Scatchard.